Andruszkiewicz Allan E, Shaffer MR, Kelly RP, Parsons K. · PeerJ · 2025

Optimizing target-to-total DNA ratio in eDNA studies: effects of sampling, preservation, and extraction methods on single-species detection.

Resumo em português

Existem muitas decisões a serem tomadas ao coletar amostras para análise de DNA ambiental (eDNA), seja utilizando um ensaio direcionado para uma única espécie ou metabarcoding baseado em comunidade. De todo o fluxo de trabalho, da coleta de água às análises bioinformáticas, as primeiras etapas do processo de coleta de água, filtragem e preservação das membranas filtrantes representam pontos críticos cujos êxitos nos processos posteriores dependem. Embora muitos estudos anteriores tenham comparado o volume de água filtrada, o tamanho dos poros do filtro, e os métodos de preservação e extração, as conclusões frequentemente indicam que eles produzem resultados diferentes, mas não é claro qual abordagem é a ideal para um dado propósito. Aqui, em vez de apresentar mais uma comparação de métodos, fornecemos uma estrutura para tomar decisões informadas a partir de uma comparação de métodos e, importante, como combinar dados coletados por diferentes escolhas metodológicas. Investigamos (1) o volume de água filtrada e o tamanho do poro do filtro e (2) o método de preservação e o método de extração das amostras, com foco específico em como essas escolhas impactam a detecção de uma espécie alvo única (golfinho-nariz-de-garrafa, Tursiops truncatus, via PCR quantitativo (qPCR)), embora, em princípio, essas descobertas se apliquem mais geralmente a ensaios de espécie única. Observamos que filtros com maior tamanho de poro (5 µm vs. 1 µm) e maiores volumes de água (3 L vs. 1 L) maximizam a razão entre DNA alvo amplificável e DNA total sem comprometer a detecção absoluta do alvo. Também constatamos que maximizar o rendimento total de DNA durante a extração (fenol-clorofórmio vs. dois kits comerciais) nem sempre aumenta a detecção do alvo, provavelmente devido à concentração de inibidores e à coextração de DNA não alvo. Comentamos ainda sobre variações, incluindo variabilidade técnica e biológica entre réplicas, constatando que a homogeneização da água fonte antes da filtragem remove grande parte da variação biológica. Por fim, apresentamos um modelo estatístico que permite a inclusão de dados de amostras coletadas e processadas por diferentes métodos, possibilitando aos pesquisadores mudar protocolos ou incluir dados de outros esforços de coleta em campo, ampliando assim as possibilidades para extensão de conjuntos de dados e análises.

Resumo original em inglês

There are many decisions to be made when sampling for environmental DNA (eDNA) analysis, whether using a targeted, single-species assay or community-based metabarcoding. Of the entire workflow from sampling water to bioinformatic analyses, the first steps in the process of collecting water, filtering it, and preserving the filter membranes represent major decision points upon which the success of downstream processes depend. Though many previous studies have compared water volume filtered, filter pore size, and preservation and extraction methods, the conclusions are often that they produce different results, but it is unclear which is the optimal approach for a given purpose. Here, rather than provide yet another methods comparison paper, we provide a framework for how to make informed decisions from a methods comparison and, importantly, how to combine data collected via different methodological choices. We investigate (1) the volume of water filtered and the filter pore size and (2) the preservation method and extraction method of samples with a specific lens on how these choices impact the detection of a single targeted species (Atlantic bottlenose dolphin, Tursiops truncatus , via quantitative PCR (qPCR)), although in principle these findings apply to single-species assays more generally. We find that larger pore size filters (5 µm vs. 1 µm) and larger volumes of water (3 L vs. 1 L) maximize the ratio of amplifiable target DNA to total DNA without compromising the absolute detection of target. We also find that maximizing total DNA yield during extraction (phenol chloroform vs. two commercial kits) does not always increase target detection likely due to the concentration of inhibitors and co-extraction of off-target DNA. We also comment on variation including technical and biological variability between replicates, finding that by homogenizing source water before filtering removes much of the biological variation. Finally, we present a statistical model that allows for inclusion of data from samples collected and processed in different ways, enabling researchers to change protocols or include data from other field sampling efforts, thereby opening up more possibilities to extend datasets and analyses.