Megan R. Shaffer, Elizabeth Andruszkiewicz Allan, Ryan P. Kelly, Nicolaus G. Adams, Stephanie K. Moore, Elizabeth Brasseale, Pedro F. P. Brandão‐Dias, Olivia M. Scott, Andrew O. Shelton, Kim M. Parsons · Metabarcoding and Metagenomics · 2026

Non-target detections change the interpretation of environmental DNA communities

Resumo em português

Amostras de DNA ambiental (eDNA) capturam misturas de DNA de uma ampla variedade de organismos e frequentemente produzem conjuntos de dados de metabarcoding que incluem táxons além do escopo pretendido pelo conjunto de primers utilizado. A presença desse DNA não-alvo (denominado “molecular bycatch”) pode dificultar a interpretação das tendências nos alvos principais. Aqui, apresentamos um exemplo no qual a inclusão de detecções não-alvo altera a interpretação ecológica de uma série temporal de metabarcoding e destacamos uma abordagem quantitativa que pode considerar o molecular bycatch de maneira biologicamente significativa. Coletamos amostras temporais de alta resolução de um estuário (Hood Canal, Washington, EUA), usando um coletor autônomo estacionado na superfície durante um período de 48 horas. Metabarcamos as amostras com um conjunto de primers que direciona peixes, mas que também amplifica (não-alvo) mamíferos marinhos com menor eficiência. Em seguida, transformamos as proporções de leituras de sequência em concentrações absolutas de DNA usando uma correção de viés baseada em uma comunidade simulada e concentrações de espécies únicas via PCR digital por gotículas (ddPCR). Verificamos que os mamíferos não-alvo estavam substancialmente sub-representados nos dados brutos de metabarcoding em relação às suas proporções corrigidas por viés. A validação cruzada dessa abordagem quantitativa de metabarcoding mostrou que as concentrações de DNA previstas correspondiam de perto às medições independentes de ddPCR para o DNA total 12S e para as concentrações de duas espécies únicas (golfinho-nariz-de-garrafa-do-atlântico e arenque-do-pacífico) tanto em comunidades simuladas quanto em amostras ambientais. Após estimar as concentrações absolutas de todas as espécies, revelamos padrões específicos de espécies que não eram aparentes apenas nas contagens observadas de leituras. Nossos resultados ressaltam a importância de corrigir o viés de amplificação específico por espécie ao avaliar a composição de comunidades a partir de dados de metabarcoding, particularmente no contexto de detecções não-alvo.

Resumo original em inglês

Environmental DNA (eDNA) samples capture mixtures of DNA from a wide range of organisms and often yield metabarcoding datasets that include taxa beyond the intended scope of the primer set used. The presence of this non-target DNA (termed “molecular bycatch”) can make it difficult to interpret trends in the primary targets. Here, we present an example in which including non-target detections alters the ecological interpretation of a metabarcoding time series and highlight a quantitative approach that can account for molecular bycatch in a biologically meaningful way. We collected high-resolution temporal samples from an estuary (Hood Canal, Washington, USA), using a surface-stationed autonomous sampler over a 48-hour period. We metabarcoded samples with a primer set that targets fish, but also amplifies (non-target) marine mammals with lower efficiency. We then transformed sequence read proportions into absolute DNA concentrations using a mock community–based bias correction and single-species concentrations via droplet digital PCR (ddPCR). We found that non-target mammals were substantially under-represented in the raw metabarcoding data relative to their biased-corrected proportions. Cross-validation of this quantitative metabarcoding approach showed that predicted DNA concentrations closely matched independent ddPCR measurements for total 12S DNA and two single-species concentrations (Atlantic bottlenose dolphin and Pacific herring) in both mock communities and environmental samples. After estimating absolute species concentrations for all species, we revealed species-specific patterns that were not apparent in the observed read counts alone. Our results underscore the importance of correcting for species-specific amplification bias when evaluating community composition from metabarcoding data, particularly in the context of non-target detections.